Ministru kabineta noteikumi Nr.569

Rīgā 2005.gada 26.jūlijā (prot. Nr.43 40.§)

Kartupeļu gaišās gredzenpuves apkarošanas un izplatības ierobežošanas kārtība

Izdoti saskaņā ar Augu aizsardzības likuma 5.panta 13.punktu

 

I. Vispārīgie jautājumi

1.Noteikumi nosaka kārtību, kādā tiek apkarota kartupeļu gaišā gredzenpuve un ierobežota tās izplatība.

2.Kartupeļu gaišo gredzenpuvi ierosina augu karantīnas organisms Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (turpmāk - organisms).

3.Lai konstatētu kartupeļu gaišo gredzenpuvi, Valsts augu aizsardzības dienests (turpmāk - dienests):

3.1.regulāri pārbauda kartupeļu Solanum tuberosum L. bumbuļus un to augus;

3.2.ņem sēklas kartupeļu un citai izmantošanai paredzēto kartupeļu Solanum tuberosum L. bumbuļu un to augu paraugus uzglabāšanas vietās un nosūta tos laboratoriskām analīzēm;

3.3.pārbauda kartupeļu Solanum tuberosum L. paraugus vizuāli, bumbuļus pārgriežot, ņem no kartupeļiem Solanum tuberosum L. paraugus un nosūta tos laboratoriskām analīzēm, ja konstatētas kartupeļu gaišās gredzenpuves vizuālās pazīmes;

3.4.saskaņā ar šo noteikumu pielikumā minētajām laboratoriskajām metodēm laboratoriski diagnosticē organismu;

3.5.piemēro, kontrolē un piespiedu kārtā veic kartupeļu gaišās gredzenpuves izplatības ierobežošanas un apkarošanas pasākumus (turpmāk - fitosanitārie pasākumi).

4.Personas nedrīkst uzglabāt vai pavairot organisma tīrkultūru, izņemot gadījumus, kas noteikti normatīvajos aktos par izmēģinājumiem vai zinātniskiem mērķiem un šķirņu selekcijai paredzēto kaitīgo organismu, augu, augu produktu un ar tiem saskarē nonākušo priekšmetu ievešanas un pārvietošanas kārtību.

II. Fitosanitāro pasākumu noteikšana

5.Ja kartupeļu Solanum tuberosum L. vizuālajā pārbaudē dienests konstatē kartupeļu gaišās gredzenpuves pazīmes vai saskaņā ar šo noteikumu pielikumā minēto imunofluorescences testu laboratoriskajā analīzē iegūts pozitīvs testēšanas rezultāts, dienests pieņem lēmumu par šādu fitosanitāro pasākumu piemērošanu:

5.1.lai novērstu organisma izplatīšanās risku, persona kartupeļu partijas vai kravas, no kurām tika ņemts paraugs, no saimniecības drīkst pārvietot tikai dienesta uzraudzībā;

5.2.aizliedz personai pārvietot no saimniecības citus nakteņu dzimtas (Solanaceae) augus (turpmāk - saimniekaugi).

6.Ja turpmākajos šo noteikumu pielikumā noteiktajos laboratoriskajos testos organisms paraugā netiek konstatēts, dienests atceļ noteiktos fitosanitāros pasākumus.

7.Lai noteiktu infekcijas izcelšanās vietu, dienests pārbauda citas kartupeļu partijas, kuras ir bijušas saistībā ar šo noteikumu 3.punktā minētajiem kartupeļiem.

8.Dienests apstiprina kartupeļu gaišo gredzenpuvi, ja divos dažādos šo noteikumu pielikumā minētajos laboratoriskajos testos tiek konstatēts organisms.

9.Ja tiek konstatēts organisms, dienests pieņem lēmumu par fitosanitāro pasākumu piemērošanu. Lēmumā ietver šo noteikumu 10., 11., 12. un 13.punktā minētās prasības.

10.Lai noteiktu infekcijas izplatību un zemesgabala plānā atzīmētu inficēto zonu (lauku, audzēšanas vietu un saimniecības kopumu, kas jebkādā veidā ir saistīti ar inficētajiem kartupeļiem), par inficētiem nosaka:

10.1.kartupeļu Solanum tuberosum L. bumbuļu vai to augu kravu vai partiju, no kuras ņemts paraugs (turpmāk - inficētie kartupeļi);

10.2.noliktavu vai tās daļu, lauksaimniecības tehniku un transportlīdzekli, kas bija saskarē ar inficētajiem kartupeļiem;

10.3.citus priekšmetus, ieskaitot iepakojumu, kas bija saskarē ar inficētajiem kartupeļiem;

10.4. lauku un audzēšanas vietu, no kuras iegūta inficēto kartupeļu raža, un zemesgabala plānā atzīmē lauku un audzēšanas vietu;

10.5.lauku un audzēšanas vietu, kur kartupeļu veģetācijas periodā ņemti kartupeļu paraugi, un zemesgabala plānā atzīmē lauku un audzēšanas vietu.

11.Lai noteiktu infekcijas izplatību un zemesgabala plānā atzīmētu inficēto zonu, par iespējami inficētiem nosaka:

11.1.visus kartupeļu bumbuļus vai to augus, ko audzē vai kas atrodas audzēšanas vietā, kurā noteikti šo noteikumu 10.punktā minētie ierobežojumi;

11.2.audzēšanas vietas vai zemesgabalus un telpas, kuras saistītas ar kartupeļu bumbuļiem vai augiem, kas noteikti par inficētiem, ieskaitot audzēšanas vietas, kas lauksaimniecības tehniku, transportlīdzekļus un telpas izmanto kopīgi ar audzēšanas vietu, kurā ir konstatēti inficētie kartupeļi;

11.3.kartupeļu bumbuļus un to augus, kuri izaudzēti šo noteikumu 11.2.apakšpunktā minētajās vietās vai atradās šajās audzēšanas vietās infekcijas noteikšanas laikā;

11.4.ražošanas vietu vai noliktavas, kurās glabājas kartupeļu bumbuļi, kas pārvietoti no šo noteikumu 11.1. un 11.2.apakš­punktā minētajām vietām;

11.5.iekārtas, lauksaimniecības tehniku, transportlīdzekļus, noliktavas un citus priekšmetus, ieskaitot iepakojumu, kas iepriekšējo 12 mēnešu laikā varēja nonākt saskarē ar inficētajiem kartupeļiem;

11.6.kartupeļu bumbuļus vai to augus, kas nonāca saskarē ar noliktavām vai citiem priekšmetiem pirms to tīrīšanas un dezinfekcijas;

11.7.kartupeļu bumbuļus vai to augus, kuri ir saistīti ar inficētās sēklas kartupeļu partijas izcelsmi vai kuri iegūti vienā vietā ar inficētajiem kartupeļiem, jo iespējama infekcijas izplatība, augus pavairojot.

12. Dienests nosaka šādus fitosanitāros pasākumus:

12.1. aizliedz stādīt inficētos un iespējami inficētos kartupeļus;

12.2. uzdod veikt vienu no šādiem pasākumiem:

12.2.1.dienesta uzraudzībā iznīcināt inficētos kartupeļus;

12.2.2.rūpnieciski pārstrādāt inficētos kartupeļus, nekavējoties nogādājot tos tieši pārstrādes uzņēmumā, kuram ir piemērotas atkritumu pārstrādes iekārtas, noliktavas un transportlīdzekļu dezinficēšanas sistēmas. Šo prasību piemēro, ja pārstrādes uzņēmums piekrīt pārstrādāt inficētos kartupeļus;

12.2.3.izpildīt citus fitosanitāros pasākumus, ja ir novērsts organisma izplatīšanās risks;

12.3. uzdod izpildīt vienu no šādiem pasākumiem:

12.3.1.dienesta uzraudzībā izlietot iespējami inficētos kartupeļus savam patēriņam vai nosūtīt pārdošanai tieši tirdzniecības vietām. Kartupeļu bumbuļus tirdzniecības vietā nogādā iepakotus, un tos nedrīkst pārpakot;

12.3.2. rūpnieciski pārstrādāt iespējami inficētos kartupeļus, nekavējoties nogādājot tos tieši pārstrādes uzņēmumā, kuram ir piemērotas atkritumu pārstrādes iekārtas, noliktavas un transportlīdzekļu dezinficēšanas sistēmas. Šo prasību piemēro, ja pārstrādes uzņēmums piekrīt pārstrādāt iespējami inficētos kartupeļus;

12.3.3.izpildīt citus fitosanitāros pasākumus, ja ir novērsts organisma izplatīšanās risks.

13.Dienests kartupeļu audzētājam uzdod audzēšanas vietās, kas noteiktas par inficētām, izvēlēties un veikt vienu no šādiem fitosanitārajiem pasākumiem:

13.1.laukos, kas noteikti par inficētiem, atkarībā no lauka izmantošanas intensitātes:

13.1.1.ja fitosanitāros pasākumus piemēro trīs gadus pēc infekcijas konstatēšanas:

13.1.1.1.iznīcināt pārziemojušos kartupeļus un citus organisma saimniekaugus;

13.1.1.2. aizliedz stādīt kartupeļu bumbuļus, to augus, sēt to sēklas, bietes un citus organisma saimniekaugus, līdz laukā nav pārziemojušu kartupeļu vismaz divus nākamos veģetācijas periodus;

13.1.1.3. trešajā audzēšanas gadā, ja vismaz divos iepriekšējos veģetācijas periodos nav atrasti pārziemojuši kartupeļi, drīkst stādīt sertificētus sēklas kartupeļus, lai iegūtu kartupeļus pārtikai, pārstrādei vai lopbarībai;

13.1.1.4. kārtējā kartupeļu audzēšanas gadā, ievērojot augu maiņu, drīkst stādīt sertificētus sēklas kartupeļus sēklas ieguvei vai citiem mērķiem paredzētus kartupeļus (pārtikai, pārstrādei, lopbarībai);

13.1.2. ja fitosanitāros pasākumus piemēro četrus gadus:

13.1.2.1.šajā periodā iznīcināt pārzie­mojušos kartupeļus un citus organisma saimniekaugus;

13.1.2.2.pirmajos trijos veģetācijas periodos laukā ierīkot un uzturēt melno papuvi, ganības ar biežu un zemu nopļaušanu vai intensīvu noganīšanu;

13.1.2.3.ceturtajā kartupeļu audzēšanas sezonā stādīt sertificētus sēklas kartupeļus sēklas ieguvei vai citiem mērķiem paredzētus kartupeļus (pārtikai, pārstrādei, lopbarībai);

13.2. pārējos laukos, ievērojot augu maiņu:

13.2.1.pirmajā veģetācijas periodā pēc infekcijas noteikšanas aizliedz stādīt kartupeļu bumbuļus, to augus, sēt to sēklas vai citus organisma saimniekaugus un uzdod iznīcināt pārziemojušos kartupeļus vai atļauj stādīt tikai sertificētus sēklas kartupeļus citiem mērķiem paredzētu kartupeļu (piemēram, pārtikai, pārstrādei, lopbarībai) ieguvei, ja ir iznīcināti visi pārziemojušie kartupeļi un citi organisma saimniekaugi un iepriekšējā gadā nav audzētas bietes;

13.2.2.otrajā veģetācijas periodā pēc infekcijas noteikšanas atļauj stādīt sertificētus sēklas kartupeļus sēklas ieguvei un citiem mērķiem paredzētus kartupeļus (piemēram, pārtikai, pārstrādei, lopbarībai);

13.2.3.katru veģetācijas periodu, kas noteikts šo noteikumu 13.2.1. un 13.2.2.apakš­punktā, uzdod iznīcināt pārziemojušos kartupeļus un citus organisma saimniekaugus;

13.3.segtajās platībās aizliedz personai stādīt kartupeļu bumbuļus un to augus, kā arī citus organisma saimniekaugus, izņemot gadījumus, ja kartupeļu audzēšanai izmantoti sertificēti sēklas kartupeļi, sīkbumbuļi vai meristēmaugi, kuri ir pārbaudīti dienestā, veikta pilnīga augšanas substrāta nomaiņa un segto platību un iekārtu tīrīšana un dezinfekcija.

14. Dienests uzdod personai dienesta uzraudzībā:

14.1.attīrīt un dezinficēt inficētās vai iespējami inficētās noliktavas, lauksaimniecības tehniku, transportlīdzekļus un citus priekšmetus, iznīcināt vai dezinficēt ar inficētajiem vai iespējami inficētiem kartupeļiem saskarē nonākušo iepakojumu. Pēc dezinfekcijas šie objekti nav vairs uzskatāmi par inficētiem vai iespējami inficētiem;

14.2.tūlīt pēc infekcijas noteikšanas un katrā nākamajā veģetācijas periodā līdz pat pirmajam atļautajam kartupeļu audzēšanas gadam laukos, kuri bija noteikti par inficētiem, veikt visas ar kartupeļu audzēšanu saistītās lauksaimniecības tehnikas un glabātavu, un segto platību tīrīšanu, kā arī, ja iespējams, - dezinfekciju;

14.3.inficētajā zonā audzēšanas vietās vismaz trīs gadus pēc infekcijas noteikšanas:

14.3.1. sēklas kartupeļus novākt, uzglabāt un pārvietot atsevišķi no citiem mērķiem (pārtikai, pārstrādei, lopbarībai) paredzētajiem kartupeļiem;

14.3.2.veikt visas ar kartupeļu audzēšanu saistītās lauksaimniecības tehnikas un glabātavu, un segto platību tīrīšanu, kā arī, ja iespējams, - dezinfekciju;

14.3.3. kartupeļu audzēšanai izmantot tikai sertificētus sēklas kartupeļus.

15.Lai noteiktu organisma iespējamo izplatību un sākotnējo infekcijas izcelšanās vietu, dienests pārbauda:

15.1.kartupeļu bumbuļus un to augus, kas saistīti ar inficēto kartupeļu partiju;

15.2.saimniecības, kas atrodas tās saimniecības tuvumā, kurā ir konstatēti inficētie kartupeļi.

16.Ja dienests organismu konstatē sākotnējā selekcijas materiālā, dienests veic tā sākotnējā selekcijas materiāla, izlases sēklu, bāzes vai augstāka ataudzējuma sēklas kartupeļu pārbaudes, kuru izcelsme saistīta ar inficēto sēklas kartupeļu partiju, un nosūta paraugu laboratoriskām analīzēm.

17. Dienests:

17.1. lēmumā norāda fitosanitāro pasākumu izpildes termiņu;

17.2. uzrauga un kontrolē fitosanitāro pasākumu izpildi;

17.3.lēmumā norādītajā laikā vietās, kas noteiktas par inficētām vai iespējami inficētām, pēc ražas novākšanas veic kartupeļu pārbaudes;

17.4.uzrauga saimniecības, noliktavas un ar kartupeļu bumbuļu pārvietošanu saistītos uzņēmumus, kā arī saimniecības, kuras izmanto lauksaimniecības tehniku uz līguma pamata kopīgi ar saimniecībām, kurās bija konstatēti inficēti kartupeļi;

17.5. lēmumam pievieno inficētās zonas karti.

18.Inficētajā zonā vismaz trīs nākamos veģetācijas periodus pēc infekcijas noteikšanas dienesta inspektors veic šo noteikumu 3.punktā minētās pārbaudes.

19.Ja kartupeļu audzētājs nav izpildījis dienesta noteiktos fitosanitāros pasākumus un inficētajās vai iespējami inficētajās platībās ir iestādījis inficētos vai iespējami inficētos vai nesertificētus kartupeļus, tad dienests piespiedu kārtā ķīmiski vai mehāniski iznīcina kartupeļu stādījumus. Ar kartupeļu iznīcināšanu saistītos izdevumus sedz kartupeļu audzētājs.

III. Eiropas Komisijas un Eiropas Savienības dalībvalstu informēšana

20.Dienests nekavējoties informē Eiropas Komisiju un Eiropas Savienības dalībvalstis par katru gadījumu, kad konstatēts organisms, un paziņojumā norāda šādu informāciju:

20.1.tās saimniecības reģistrācijas numurs fitosanitārajai kontrolei pakļauto augu un augu produktu apritē iesaistīto personu reģistrā, kurā atrodas audzēšanas vieta, kas noteikta par inficētu;

20.2.tā fitosanitārā sertifikāta vai augu pases numurs, kas pievienots inficētajai saimniekaugu kravai vai partijai;

20.3.inficēto sēklas vai citiem mērķiem (piemēram, pārtikai, pārstrādei, lopbarībai) paredzētu kartupeļu šķirņu nosaukumi;

20.4.noteiktās inficētās zonas apraksts un tajā noteiktie fitosanitārie pasākumi;

20.5.šo noteikumu 8.punktā minētās testēšanas rezultāts (ekstrakts, imunofluorescences analīzei sagatavotais priekšmetstikliņš, inficētais baklažānu (Solanum melongena) materiāls un organisma tīrkultūra).

21. Ja dienests plāno piemērot citus fitosanitāros pasākumus inficēto un iespējami inficēto kartupeļu izmantošanai, pirms šo pasākumu piemērošanas dienests informē par šiem pasākumiem Eiropas Komisiju un Eiropas Savienības dalībvalstis.

Informatīva atsauce uz Eiropas Savienības direktīvu

Noteikumos iekļautas tiesību normas, kas izriet no Padomes 1993.gada 4.oktobra Direktīvas 93/85/EEK par kartupeļu gaišās gredzenpuves kontroli.

Ministru prezidents A.Kalvītis

Zemkopības ministra vietā - vides ministrs R.Vējonis

Redakcijas piebilde: noteikumi stājas spēkā ar 2005.gada 10.augustu.

 

Pielikums

Ministru kabineta

2005.gada 26.jūlija noteikumiem Nr.569

Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus atklāšana un identificēšana kartupeļu bumbuļu paraugos

I. Analizējamais paraugs

1.Testējamā parauga standarta lielums ir 200 bumbuļu. Var testēt arī mazāka apjoma paraugus.

2. Paraugu sagatavošana testēšanai:

2.1. kartupeļu bumbuļus pārskaita, nomazgā un ļauj tiem apžūt;

2.2.ar dezinficētu skalpeli noņem kartupelim mizu stolona piestipri­nāšanas vietā un izgriež 3-5 mm lielus vadaudu gabaliņus;

2.3.vadaudu gabaliņus ievieto vienreiz lietojamā traukā un pārlej ar 40-50 ml macerācijas buferšķīduma. Ieteicams izgrieztos audus apstrādāt nekavējoties. Ja tūlītēja apstrāde nav iespējama, paraugu uzglabā līdz 72 stundām +4°C līdz +10°C temperatūrā vai līdz 24 stundām istabas temperatūrā;

2.4.paraugu četras stundas inkubē kratītājā ar 50 līdz 100 apgriezieniem minūtē;

2.5.macerātu nolej un koncentrē baktērijas, centrifugējot paraugu (10000 g) 10 minūtes +4 °C līdz +10 °C temperatūrā;

2.6.nolej centrifugāta šķidrumu, neskarot nogulsnes. Iegūtās nogulsnes šķīdina 1,5 ml nogulšņu buferšķīdumā, un paraugu sadala tālākām analīzēm:

2.6.1.1000 μl izmanto baktēriju Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus un Pseudomonas solanacearum noteikšanai;

2.6.2.500 μl uzglabā references nolūkiem. Parauga references daļai pievieno 200 μl sterila glicerīna, samaisa un uzglabā -75°C līdz -85°C temperatūrā;

2.7.testēšanas laikā izgriezto vadaudu paraugu un nogulšņu suspensiju uzglabā +4°C līdz +10 °C temperatūrā.

II. Imunofluorescences tests

3.Imunofluorescences (turpmāk - IF) testā izmanto daudzlodziņu mikroskopa priekšmetstikliņus. Uz priekšmetstikliņiem ar zīmuli uzraksta CMS un parauga identifikācijas numuru.

4.Sagatavo nogulšņu decimālus atšķaidījumus 1/10, 1/100 un 1/1000. Mēģeni ar nogulsnēm sajauc vorteksā. Ar pipeti uzpilina nogulšņu un katra atšķaidījuma standarta daudzumu - 20 ml - lodziņu rindai (tabula). Atlikušo rindu izmanto par dublikātu vai otrajam paraugam.

Tabula

	Neatšķaidīts	1/10	1/100	1/1000
1.paraugs	2 1	2 2	2 3	2 4	2 5
1.parauga dublikāts vai 2.paraugs	2 6	2 7	2 8	2 9	2 10

5.Sagatavo atsevišķu pozitīvās kontroles priekšmetstikliņu (tāpat kā paraugu). Negatīvai kontrolei izmanto nogulšņu buferšķīdumu. To pilina 5. un 10.priekšmetstikliņa acī neatšķaidītu. Katram testu komplektam izmanto vienu priekšmetstikliņu.

6. Paraugus žāvē, līdz priekšmetstikliņi ir sausi. Priekšmetstikliņus inkubē 10 minūtes 96% etanolā un apdedzina.

7.Sagatavo IF buferšķīdumā antivielas darba atšķaidījumu, kā norādīts ražotāja instrukcijā.

8.Pārklāj testa lodziņus ar antivielas atšķaidījumu (lodziņiem izmantotajam antivielas daudzumam jābūt vienādam ar izmantoto nogulšņu daudzumu) un inkubē 30 minūtes mitrā kamerā istabas temperatūrā, ja antivielas ražotāja instrukcijā nav norādīts citādi.

9.Nokrata no priekšmetstikla antivielas pilienus, un slaidus uzmanīgi noskalo ar IF buferšķīdumu. Mazgā divas reizes pa piecām minūtēm IF buferšķīdumā. Uzmanīgi nosusina lieko mitrumu.

10. Sagatavo IF buferšķīdumā fluorescīnizotiocianāta (turpmāk - FITC) konjugāta darba atšķaidījumu, kā norādīts ražotāja instrukcijā.

11.Pārklāj testa lodziņus ar FITC konjugāta atšķaidījumu (lodziņiem izmantotajam konjugāta atšķaidījuma daudzumam jābūt vienādam ar izmantoto antivielas atšķaidījuma daudzumu) un inkubē 30 minūtes mitrā kamerā istabas temperatūrā, ja FITC konjugāta ražotāja instrukcijā nav norādīts citādi.

12.Nokrata no slaida konjugāta pilienus. Skalo un mazgā, kā minēts iepriekš. Uzmanīgi nosusina lieko mitrumu.

13.Ar mikropipeti uz katra lodziņa uzpilina 5-10 ml fosfāta un glicerīna buferšķīduma vai līdzīga montējoša līdzekļa un pārklāj ar segstikliņu.

14.Apskata priekšmetstikliņa testa lodziņus luminiscentā mikroskopā ar filtriem, kas piemēroti FITC, izmantojot eļļas imersiju ar palielinājumu 1000reizes. Apskata lodziņus pa diviem diametriem taisnos leņķos un apkārt pa perimetru.

15.Vispirms pārbauda pozitīvās un negatīvās kontroles priekšmetstikliņu. Pozitīvās kontroles šūnām jābūt spilgti fluorescējošām un pilnībā nokrāsotām. Ja tās nav nokrāsotas, testu atkārto. Negatīvās kontroles lodziņos nedrīkst būt tipiskas fluorescējošas šūnas, pretējā gadījumā testu atkārto.

16.Meklē priekšmetstikliņa testa lodziņos tipiskas fluorescējošas šūnas ar raksturīgu Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus morfoloģiju. Fluorescences intensitātei jābūt tādai pašai kā attiecīga atšķaidījuma pozitīvai kontrolei. Šūnas ar nepilnu krāsojumu vai ar vāju fluorescenci ignorē. Ja šādu šūnu ir daudz, pamatojas uz IF testa rezultātu skaidrojumu.

17. IF testa rezultātu interpretācija:

17.1.ja spilgtās fluorescējošās šūnas ar raksturīgu morfoloģiju netiek atrastas, IF tests ir negatīvs;

17.2.ja spilgtās fluorescējošās šūnas ar raksturīgu morfoloģiju tiek atrastas, nosaka vidējo šūnu skaitu objektīva redzes laukumā un aprēķina šūnu skaitu (N) atkārtoti suspendēto nogulšņu mililitrā. Par robežu IF testam tiek uzskatīta aptuveni 10³ šūnu populācija atkārtoti suspendēto nogulšņu mililitrā:

17.2.1.paraugiem, kuros N lielāks par 10³ šūnu atkārtoti suspendēto nogulšņu mililitrā, IF tests tiek uzskatīts par pozitīvu;

17.2.2.paraugiem, kuros N mazāks par 10³ šūnu atkārtoti suspendēto nogulšņu mililitrā, IF tests tiek uzskatīts par iespējami pozitīvu;

17.3.ja ir redzams liels skaits (> 10⁵ šūnas mililitrā) nepilnīgi vai vāji fluorescējošu šūnu, IF tests tiek uzskatīts par iespējami pozitīvu.

III. PCR tests

18. Baktērijas DNS izdalīšana:

18.1. ievieto 220 μl lizēšanas bufera mikromēģenē;

18.2. pievieno 100 μl paraugu ekstrakta;

18.3. paraugu inkubē 95 °C temperatūrā 10 minūtes;

18.4. turpina parauga inkubēšanu uz ledus 5 minūtes;

18.5. pievieno 80 μl lizozīma koncentrāta;

18.6. inkubē paraugu 37 °C 30 minūtes;

18.7. pievieno 220 μl EasyDNA šķīduma A, invertē paraugu;

18.8. inkubē 65 °C 30 minūtes;

18.9. pievieno 100 μl EasyDNA šķīduma B, invertē paraugu, līdz veidojas viskozs šķīdums;

18.10. pievieno 500 μl hloroforma un labi sakrata;

18.11. centrifugē paraugu (15000 g) 20 minūtes +4 °C temperatūrā;

18.12. virsējo fāzi pārnes jaunā mikromēģenē;

18.13. pievieno 1 ml atdzesēta (-20 °C) 96% etanola;

18.14. centrifugē paraugu (15000 g) 20 minūtes +4 °C temperatūrā;

18.15. nolej šķidro fāzi;

18.16. pievieno 500 μl atdzesēta (-20 °C) 80% etanola;

18.17. centrifugē paraugu (15000 g) 20 minūtes +4 °C temperatūrā;

18.18. nolej šķidro fāzi;

18.19. žāvē nogulsnes istabas temperatūrā;

18.20. nogulsnes šķīdina 100 μl sterila destilēta ūdens;

18.21. inkubē paraugu istabas temperatūrā 20 minūtes;

18.22. pārvieto paraugu -20 °C temperatūrā turpmākai uzglabāšanai.

19. PCR testa norise:

19.1. sagatavo PCR reakcijas maisījumu;

19.2. PCR reakcijas mēģenē ievieto 20 ml reakcijas maisījuma;

19.3.katrā mēģenē ievieto 5 μl analizējamā parauga. Katru paraugu analizē atkārtoti;

19.4. paraugus ievieto termoprocesorā.

20. PCR produktu sadalīšana agarozes gelā:

20.1. pagatavo agarozes maisījumu un uzlej gelu;

20.2. gelam uzliek 12 μl PCR produkta;

20.3. malējās gela bedrītēs ievieto 3 μl 100 bāzu pāru (turpmāk - bp) DNS marķiera;

20.4. sadala PCR produktus elektriskajā laukā ar strāvas stiprumu 65 mA un spriegumu 130 V 60-80 minūtes;

20.5. pārnes gelu etīdija bromīda šķīdumā un krāso 30 minūtes;

20.6. novieto gelu uz transiluminatora un aplūko PCR produktus UV gaismā.

21. PCR testā iegūto datu interpretācija:

21.1. ja negatīvās kontroles bedrītē nedetektē atbilstoša bp garuma PCR amplikonus, PCR testu uzskata par negatīvu;

21.2. ja bedrītē identificē fragmentu garumus atbilstoši pozitīvās kontroles signālam, paraugu uzskata par pozitīvu.

IV. Bioloģiskās patogenitātes (baklažāna) tests un identifikācijas testi

22.Baklažānus (Solanum melongena) audzē siltumnīcā +21°C līdz +24°C temperatūrā dienā, bet naktī - temperatūrā, kas nav zemāka par +15 °C. Baklažāniem nodrošina pietiekamu apgaismojumu (aptuveni 14 stundas). Temperatūra nedrīkst būt augstāka par +30 °C. Potēšanai ņem baklažānus trešās lapas attīstības stadijā. Svarīgi inficēt pēc iespējas jaunākus au­gus, kas ir uzņēmīgāki pret nelielu infekciju nekā vecāki indikatoraugi.

23.Vienam paraugam ņem 35 augus (25 augus, piecus augus pozitīvai kontrolei un piecus augus negatīvai kontrolei). Uz podiņa ar baklažāna stādu uzraksta parauga identifikācijas numuru un norāda, vai tas ir pozitīvās kontroles augs vai negatīvās kontroles augs.

24.Potēšanu sāk ar negatīvās kontroles augu, tad ņem paraugu un beigās- pozitīvās kontroles augu.

25. Potē uz stublāja starp dīgļlapām un pirmo lapu. Dienu pirms potēšanas vēlams augus nelaistīt. Stublāju ieskrāpē 0,5-1,0 cm garumā un trīs ceturtdaļu dziļumā. Ar šļirci vai pipeti iepilina paraugu stublājā un aizlipina ar parafīnu, lai neizžūst. Tāpat rīkojas arī ar kontroles augiem.

26. Pozitīvās un negatīvās kontroles augus noliek atsevišķi no parauga.

27. Pēc nedēļas sāk regulāru simptomu novērošanu. Ja ir lapu vīšana, uz vītušajiem audiem sākumā var parādīties tumši zaļi, lāsumaini plankumi mozaīkas veidā, kas palēnām kļūst blāvāki, līdz sasniedz nekrotisku stadiju. Nekrotiskie audi veido stipri izteiktu dzeltenu lapas malu, kas pamazām izplatās pa visu baklažāna lapu. Inficētie indikatoraugi, kas uzrāda Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus raksturīgās pazīmes, pilnībā var neaiziet bojā. Augi spēj reģenerēties pēc infekcijas, veidojot sānu dzinumus un jaunas atvases.

28. Identifikācijas testu norise:

28.1.tālākai testēšanai ņem lapas ar simptomiem vai stublāju virs inficētās vietas, dezinficē ar 70% etanolu, sagriež mazos gabaliņos, pārlej ar sterilu ūdeni, atstāj uz 15 minūtēm, tad ar ekstraktu veic IF un PCR testus;

28.2. ja pēc četrām nedēļām augiem simptomi nav novērojami, veic IF un PCR testus. Ņem 1 cm lielas stublāja daļas (virs inficētās vietas) no visiem augiem, dezinficē ar 70% etanolu, sagriež mazos gabaliņos, pārlej ar sterilu ūdeni un atstāj uz 15 minūtēm, tad ar ekstraktu veic IF un PCR testus;

28.3. ja nepieciešama papildu patogēna atkārtota izdalīšana no baklažāna, testēšanai ņem lapas ar simptomiem vai stublāju virs inficētās vietas, dezinficē ar 70% etanolu, sagriež mazos gabaliņos, pārlej ar sterilu ūdeni un atstāj uz 15 minūtēm, uzsēj uz rauga peptona glikozes agara YPGA, inkubē +21°C līdz +25°C temperatūrā. Kolonijas novēro katru dienu, tās aug ļoti lēni (līdz 10 dienām), ir krēma krāsā, sīkas, kupolveida. Izaugušās kolonijas pārsēj un ar tīrkultūru (atšķaidot koloniju ar 1 ml nogulšņu buferšķīduma, koloniju ņemot ar 1 ml cilpu) veic IF testu. (IF testam nogulšņu vietā ņem ekstraktu no kolonijām.)

29. Veic arī šādus testus:

29.1.krāsošana pēc Grama (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus +);

29.2. oksidāzes tests (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus -).

30.Bioloģiskās patogenitātes (baklažāna) testa un identifikācijas testu rezultātu interpretācija:

30.1. ja baklažāna tests paraugam ir negatīvs (nav simptomu), bet pozitīvā kontrole ir pozitīva, negatīvā kontrole ir negatīva un IF un PCR testi ir negatīvi, paraugs tiek uzskatīts par negatīvu;

30.2. ja baklažāna tests paraugam ir negatīvs (nav simptomu), bet pozitīvā kontrole ir pozitīva, negatīvā kontrole ir negatīva un IF un PCR testi ir pozitīvi, paraugs tiek uzskatīts par pozitīvu;

30.3.ja baklažāna tests paraugam ir pozitīvs (ir simptomi), pozitīvā kontrole ir pozitīva, bet negatīvā kontrole ir negatīva un IF un PCR testi ir pozitīvi, paraugs tiek uzskatīts par pozitīvu;

30.4.ja apstiprinošo testu (IF, PCR) rezultāti nesakrīt, veic patogēna atkārtotu izdalīšanu no baklažāna;

30.5.ja ir tipiskas Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus kolonijas un IF tests ir pozitīvs, paraugs tiek uzskatīts par pozitīvu;

30.6.ja nav tipisku Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus koloniju un IF tests ir negatīvs, paraugs tiek uzskatīts par negatīvu.

31.Pēc skrīninga testiem - IF testa un PCR testa - norāda, vai konstatēts Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Ja Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus ir konstatēts, raksta piebildi "Testēšana tiek turpināta, izmantojot bioloģiskās patogenitātes (baklažāna) testu un identifikācijas testus" un galīgo atzinumu par paraugu sniedz pēc šo testu rezultātu iegūšanas.

V. Izmantotie šķīdumi

32. Macerācijas buferšķīdums:

32.1.0,05 M fosfāta (PBS) buferšķīdums, pH 7,0;

32.2. Na₂HPO₄ - 4,26 g;

32.3. KH₂PO₄ - 2,72 g;

32.4. destilēts ūdens - 1000 ml;

32.5. izšķīdina sastāvdaļas un pārbauda pH;

32.6. buferšķīdumu sterilizē autoklāvā +121 °C temperatūrā 15 minūtes.

33. Nogulšņu buferšķīdums:

33.1.0,01 M fosfāta (PBS) buferšķīdums, pH 7,2;

33.2. Na₂HPO₄ · 12H₂O - 2,7 g;

33.3. Na₂HPO₄ · 2H₂O - 0,4 g;

33.4. destilēts ūdens - 1000 ml;

33.5. izšķīdina sastāvdaļas un pārbauda pH;

33.6. buferšķīdumu sterilizē autoklāvā +121 °C temperatūrā 15 minūtes.

34. IF-buferšķīdums:

34.1.0,01 M fosfāta (PBS) buferšķīdums, pH 7,2;

34.2. Na₂HPO₄ · 12H₂O - 2,7 g;

34.3. Na₂HPO₄ · 2H₂O - 0,4 g;

34.4. NaCl - 8,0 g;

34.5. destilēts ūdens - 1000 ml;

34.6. izšķīdina sastāvdaļas un pārbauda pH;

34.7. buferšķīdumu sterilizē autoklāvā +121 °C temperatūrā 15 minūtes.

35. Fosfāta glicerīna buferšķīdums:

35.1.0,1 M fosfāta glicerīna (PGBS) buferšķīdums, pH 7,6;

35.2. Na₂HPO₄ · 12H₂O - 3,2 g;

35.3. NaH₂PO₄ · 2H₂O - 0,15 g;

35.4. glicerīns - 50 ml;

35.5. destilēts ūdens - 100 ml;

35.6. izšķīdina sastāvdaļas un pārbauda pH;

35.7. buferšķīdumu sterilizē autoklāvā +121 °C temperatūrā 15 minūtes.

36. Lizēšanas buferšķīdums:

36.1.100 mM NaCl;

36.2.10 mM Tris-HCl (Tris(hidroksimetil)aminoetāns) (pH 8,0);

36.3.1 mM EDTA (etilēndiamīntetraetiķskābes dinātrija sāls) (pH 8,0).

37. Lizozīma koncentrāts:

37.1.50 mg lizozīma;

37.2.1 ml 10 mM Tris-HCl.

38. Elektroforēzes buferšķīdums:

38.1.10 reizes TAE (TrisAcetātaEDTA);

38.2. tris bāze - 48,4 g;

38.3. ledus etiķskābe - 11,42 ml;

38.4. EDTA - 3,72 g;

38.5. H₂O - līdz 1000 ml.

39. Etīdija bromīda šķīdums. Vienu reizi TAE buferšķīdumam pievieno etīdija bromīda koncentrātu (10 mg/ml) ar gala koncentrāciju 0,5 mg/ml.

40. PCR reakcijas maisījums:

Nr. p.k.	Reaģents	Daudzums vienai reakcijai (ml)
40.1.	Sterils destilēts ūdens	9,5
40.2.	10xPCR buferis	2,5
40.3.	25mM MgCl2	3
40.4.	dNTP's	0,5
40.5.	PSA-1	1,0
40.6.	PSA-R	1,0
40.7.	NS-7-F	1,0
40.8.	NS-8R	1,0
40.9.	Taq polimerāze	0,5
40.10.	NS-8R	1,0
40.11.	Taq polimerāze	0,5
40.12.	Paraugs	5,0

VIII. PCR izmantoto oligonukleotīdu sekvences un programmatūra

1.tabula

Nr. p.k.	Oligonukleotīds	Oligonukleotīda sekvence	Amplikona garums (bp)
1.	PSA-1	5'- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa-3'	502
2.	PSA-R	5'- tac tga gat gtt tca ctt ccc c-3'
3.	NS-7-F	5'- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc-3'	377
4.	NS-8-R	5'- tcc gca ggt tca cct acg ga-3'

2.tabula

Nr. p.k.	Ciklu skaits	Ilgums	Temperatūra (°C)	Rīcības mērķis
1.	1	3 min	95	Genomiskās DNS denaturācija
2.	10	1 min	95	Genomiskās DNS denaturācija
		1 min	64	Oligonukleotīdu hibridizācija
		1 min	72	Fragmenta sintēze
3.	25	30 s	95	Genomiskās DNS denaturācija
		30 s	62	Oligonukleotīdu hibridizācija
		30 s	72	Fragmentu sintēze
4.	1	5 min	72	Fragmentu galu aizpildīšana
		Uzglabā, kamēr paraugs atrodas termostatā	4	-

IX. Testēšanas materiāla saglabāšana un uzglabāšana

49.Ja ir aizdomas par organisma klātbūtni, jo ir iegūts pozitīvs imunofluorescences testa rezultāts pēc metodes, kas noteikta šajā pielikumā, un nepieciešams turpināt laboratoriskās izmeklēšanas testus, lai apstiprinātu vai neapstiprinātu šī organisma klātbūtni paraugā, līdz testa pabeigšanai saglabā un attiecīgi uzglabā līdz laboratorijas testu pabeigšanai:

49.1. ja iespējams, visus bumbuļus vai augus, no kuriem noņemti paraugi;

49.2.jebkādas ekstrakta koncentrāta paliekas un papildus sagatavotos imunofluorescences priekšmetstikliņus.

50.Ja laboratoriskajās analīzēs saskaņā ar šajā pielikumā minētajām metodēm organisma klātbūtne paraugā tiek apstiprināta, vismaz vienu mēnesi jāsaglabā un attiecīgi jāuzglabā:

50.1. šī pielikuma 1.punktā norādītais materiāls;

50.2. inficētā baklažānu materiāla paraugs, kas ir inokulēts ar bumbuļu vai augu ekstraktu;

50.3. šī organisma nodalītā tīrkultūra.

Zemkopības ministra vietā - vides ministrs R.Vējonis